本实验所用藻种为从北京市平谷区某沼气站的土壤中自行分离纯化而得到的一株小球藻Chlorella sp. M-12，其含油率最高可达50%。藻种的培养基为BG-11^[18]，培养温度为(25±1)℃，光照强度为200 μmol·(m²·s)⁻¹，光照周期L∶D(光∶暗)为12∶12。微藻生长3 d后进入指数增长期，后续实验均采用指数增长期获得的微藻作为供试藻种。微藻的干重-光密度曲线见式(1)。

式中：Y为微藻细胞干重，mg·L⁻¹；$\,\rho_{\rm{L}} $为光密度；R²为拟合度。

实验所用黑曲霉(Aspergillus niger)购自中国微生物菌种保藏中心(CGMCC，编号XZ0007)。将其接种于灭菌后的麦芽汁试管斜面固体培养基^[13]内，以制备黑曲霉孢子悬浊液。接种的黑曲霉生长50~70 h后进入对数生长期，此时试管内形成表面带有黑色颗粒状孢子的白色菌丝球。将0.5 mL灭菌的马丁氏培养基^[12]加入上述盛有菌丝球的斜面试管中，将孢子振荡至马丁氏培养基中，并将其转移至5 mL灭菌离心管中，最终采用无菌水将孢子悬浊液稀释至50 mL，并置于250 mL三角瓶中备用。使用无菌吸管将上述制备的黑曲霉孢子悬浊液1 mL转移至灭菌的、盛有100 mL马丁氏培养基的250 mL三角瓶中，置于恒温振荡培养器中(培养温度为28 ℃、pH为6.0、转速为150 r·min⁻¹)。培养约30 h后会形成肉眼可见成团的菌丝颗粒，随后很快形成菌丝球。第4天即可得到大量大小均匀、吸附性能良好的菌丝球(此时菌丝球干重为1.40~1.60 g·L⁻¹、直径为4~5 mm)。

供试污水采用经过厌氧发酵及絮凝-好氧生物滤池法处理过的猪粪沼液。该沼液的COD、${\rm{NH}}_4^{+} $-N与TP浓度分别为1 100~1 200 mg·L⁻¹、700~730 mg·L⁻¹及32~40 mg·L⁻¹。沼液pH为8.0~8.5。

考察Chlorella sp. M-12对不同沼液稀释液中COD、NH₄⁺-N和TP的去除效果及藻生物量积累状况。反应器为250 mL锥形瓶，供试体积为150 mL。猪粪沼液经过0.22 µm滤膜过滤后，用去离子水稀释至6个不同的沼液浓度梯度(2.5%、5%、10%、15%、20%、25%；对应氨氮质量浓度分别为24、40、89、124、150、182 mg·L⁻¹)。相应地，COD 、NH₄⁺-N与TP质量浓度分别为100~300、24~182及2.0~10.0 mg·L⁻¹。将处于对数生长期的微藻接种于上述6组猪粪沼液中，每组实验重复3次。微藻的初始接种量为30~100 mg·L⁻¹(干重)，每隔2 d测定污水中的COD、NH₄⁺-N与TP质量浓度及微藻干重。

1)黑曲霉菌丝球絮凝收获Chlorella sp. M-12条件优化。考察不同的菌、藻干重比，初始pH，培养温度，培养转速对黑曲霉菌丝球絮凝收获Chlorella sp. M-12的效果。所有处理组的反应器为250 mL锥形瓶；黑曲霉菌丝球在藻液中停留时间为2 h，每组实验重复3次。

菌藻干重比。设置黑曲霉菌丝球∶微藻(菌藻干重比)比为1∶1、1∶2、1∶3。制取干重为1.6 g·L⁻¹的黑曲霉菌丝球混合液。将上述混合液于2 000 r·min⁻¹下离心2 min后弃去上清液，获得黑曲霉菌丝球备用。制备符合上述菌藻干重之比的Chlorella sp. M-12藻液。将制取的Chlorella sp. M-12藻液于7 000 r·min⁻¹离心15 min后弃去上清液获得藻细胞，再用100 mL蒸馏水将其转移至250 mL三角瓶中，摇动三角瓶使其分散均匀。调节藻液初始pH为6.0，加入已制备好的黑曲霉菌丝球，设置温度为28 ℃，培养转速为180 r·min⁻¹。

初始pH。采用1 mol·L⁻¹的盐酸和1 mol·L⁻¹氢氧化钠溶液调节Chlorella sp. M-12藻液初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，再加入黑曲霉菌丝球。设置菌藻干重比为1∶1、温度为28 ℃、培养转速为180 r·min⁻¹。

温度。温度梯度设置为24、28、32和36 ℃。初始pH为6.0，菌藻干重比为1∶1、温度为28 ℃、培养转速为180 r·min⁻¹。

培养转速。转速分别设置为120、140、160和180 r·min⁻¹。设置菌藻干重比为1∶1、初始pH为6.0、温度为28 ℃。

上述所有实验处理组均每隔15 min取8 mL上清液测定OD₆₈₀。

2)黑曲霉菌丝球絮凝收获Chlorella sp. M-12机制。采用培养成熟的黑曲霉菌丝球作为实验材料，设置4组处理：1)空白对照组，即菌丝球的EPS未经处理且菌丝球保存完好的组别，目的是为了考察EPS未失活状态下与黑曲霉菌丝共同作用对Chlorella sp. M-12收获率的影响；2)失活EPS+完整菌丝球组，即将菌丝的EPS移除但保留菌丝结构完整性的处理组，其目的是为了考察完整的、未遭到破坏的菌丝球对Chlorella sp. M-12收获率的影响；3)EPS+无菌丝球，即提取了黑曲霉菌丝球的EPS并将其加入藻液中进行絮凝的处理组，代表了只有EPS而无菌丝的作用下对Chlorella sp. M-12收获率的影响；4)失活EPS+破碎菌丝，即移除菌丝球的EPS并将菌丝球剪碎的处理组，其目的是为了考察在菌丝球完整结构被破坏与失活的EPS作用下，Chlorella sp. M-12收获率变化。将菌丝球置于70 ℃的恒温水浴锅中加热30 min可以获得失活的EPS菌丝球^[22-23]；剪碎菌丝球处理组则用灭菌后的剪刀或美工刀将完整的菌丝球剪碎，破坏其完整结构。

黑曲霉菌丝球直径采用游标卡尺进行测量^[14]。黑曲霉菌丝球干重的测量参考《水与废水监测分析方法(第四版)》中的残渣测量方法^[24]。pH、COD、NH₄⁺-N及TP指标参考《水与废水监测分析方法(第四版)》中相应方法 ^[24]。微藻Chlorella sp. M-12生物量测定采用光密度法^[24]。EPS的提取与测量方法参见参考文献^[22-23]。采用扫描电镜(JSM-7001F，日本电子公司)对收获微藻前后的黑曲霉菌丝球形态与结构进行观察。

微藻收获率的计算方法见式(2)。

式中：R为收获效率；N₀为藻细胞初始光密度；N_t为絮凝后剩余藻细胞光密度。

在不同污染物质量浓度下，Chlorella sp. M-12对猪粪沼液中${\rm{NH}}_4^{+} $-N与TP的去除率如图1所示。结果表明，各组${\rm{NH}}_4^{+} $-N与TP浓度随处理时间的延长均有所下降。其中，${\rm{NH}}_4^{+} $-N去除率的最高值出现在24 mg·L⁻¹ ${\rm{NH}}_4^{+} $-N组(图1(a))，达84.18%。TP去除率的最高值出现在24和40 mg·L⁻¹ ${\rm{NH}}_4^{+} $-N组，均达100%(图1(b))。上述结果表明，Chlorella sp. M-12具有较强的脱氮除磷潜力。微藻生物量的最高值出现在24 mg·L⁻¹ ${\rm{NH}}_4^{+} $-N组，达350 mg·L⁻¹(图1(c))，即每消耗1 g的${\rm{NH}}_4^{+} $-N可产出4.3 g微藻干物质。另外，微藻在水体中通常采用光自养模式生存，所利用的碳源为空气中CO₂。在本研究中，COD去除率为30%~50%。这说明，在含有机物的猪粪沼液中，Chlorella sp. M-12采用了兼养模式生存，回收了一部分有机碳源。

1)菌藻干重比对絮凝收获Chlorella sp. M-12的影响。由图2(a)可知，较高的菌藻干重之比有利于Chlorella sp. M-12的絮凝收获。在反应1 h之内，黑曲霉菌丝球与Chlorella sp. M-12干重之比为1∶1组的收获率最高，达到94.2%。这与叶晨松^[15]和XIE等^[16]的研究结果一致，即最佳菌藻的投量之比为1∶1时，微藻的絮凝收获率最高，可达98%。同时，因叶晨松^[15]和XIE等^[16]所使用的青霉、刺孢小克银汉霉菌与黑曲霉同样都属于霉菌，而霉菌絮凝收获微藻可能是由于霉菌胞外EPS及自身结构的网捕卷扫作用造成的，因此，提高菌藻干重比，可显著提高微藻的收获率。

2)初始pH对黑曲霉收获Chlorella sp. M-12的影响。由图2(b)可知，初始pH对Chlorella sp. M-12的收获率具有一定的影响。当pH为5.0~10.0时，Chlorella sp. M-12的收获率随pH的升高呈现先升后降的趋势。初始pH在5.0~8.0的范围内，Chlorella sp. M-12收获率均可达85%以上。尤其当pH为6.0时，Chlorella sp. M-12收获率最高，达到94.7%。而当pH达到9.0时，微藻收获率降低至69.2%，当pH达到10.0时，微藻收获率降低至15.0%。上述结果与前人的研究结果略有差异，叶晨松^[15]、顾琼等^[25]和ZHOU等^[20]分别利用了青霉、卷枝毛霉和米曲霉收获普通小球藻，得到的最适pH分别是4.0、6.0和4.0，其收获率分别达到了99%、81%和100%。

微藻适宜生长pH范围通常为5~11，此时溶液等电点能使带负电的细胞相互排斥，保持细胞分散且稳定的状态^[26]。在微藻生长的过程中，其细胞代谢产物会不断溶解至培养液中，导致培养液pH逐渐升高，最终呈碱性。而大部分真菌在偏酸性环境中生长更为旺盛，形成的菌丝活性更强，更容易形成菌丝球，并且该过程会产生一定量的EPS，有利于吸附微藻细胞^[12]。本研究结果与其他研究结果的差异，可能是由于所使用的真菌所适宜生长的pH范围不同造成的。

3)温度对黑曲霉菌丝球收获Chlorella sp. M-12的影响。图2(c)表明，在24~36 ℃下，各组Chlorella sp. M-12收获率均在91%~94%，且各组之间差异性不明显。这与前人的研究结论一致，即在25~40 ℃时，菌丝球对栅藻的吸附率均可达90%以上^{[15-18, 26]}。其原因可能是：在较短的吸附时间内(15~20 min)，温度梯度的变化对真菌及微藻的生理生化代谢活动影响程度较低。

4)转速对黑曲霉菌丝球收获Chlorella sp. M-12的影响。图2(d)表明，当转速为180 r·min⁻¹时，Chlorella sp. M-12收获率最高，达到91%。而当转速低于180 r·min⁻¹时(120、150 r·min⁻¹)，Chlorella sp. M-12的收获率仅为40%~50%。然而，高转速也不利于微藻收获：当转速升至210 r·min⁻¹时，Chlorella sp. M-12的收获率低于60%。这与裴轩瑗^[18]的研究结果类似，即适宜的转速(160 r·min⁻¹)可保证黑曲霉对栅藻的收获率达到最高(96%)。

传统的絮凝主要包括网捕卷扫、电荷中和与吸附架桥3种作用方式^[27-29]。在不同的转速下，菌丝球与微藻的接触程度也各不相同，进而导致上述3种絮凝作用方式产生不同的效果。有研究表明，菌丝球收获微藻的效果，一方面取决于两者的碰撞概率；另一方面取决于菌丝球的吸附性能^[27]。而碰撞概率又由微生物粒径、微生物形状和相对运动所决定，因此，可以通过改变转速，调整菌丝球与微藻之间的相互运动，从而影响2者的碰撞概率，并最终获得较高的微藻收获率。在慢速条件下，菌体和微藻的相对运动较慢、碰撞效果较差，大部分微藻不能较好地附着在菌丝球上；而当转速过高时，菌丝球可能会因水流剪切力过大而阻碍菌丝球表面絮凝物质/电荷与微藻细胞之间的相互作用，甚至破坏菌丝球的完整结构，从而降低微藻收获率^[27-28]。因此，保持合适的转速可以增加混合液体的湍流，使得藻细胞产生一定的动能，从而克服水流阻力进入菌丝球内部，并更好地黏附在菌丝上，实现较高的收获率。

前人研究普遍采用不同属的霉菌进行藻细胞收获^{[15-18, 26]}。其中，发现对收获效果影响较大的因素是初始pH。最佳pH多在霉菌最适生长的pH范围内。这说明，霉菌的生长状态对微藻的絮凝采收起到了重要作用。另外，适宜的转速对真菌絮凝藻细胞效果有一定的影响，这说明除了碰撞产生的作用外，霉菌与微藻细胞之间的电荷相互作用，可能是影响微藻絮凝效果的原因之一。另外，温度对真菌絮凝微藻效果普遍影响不大。

菌丝球收获Chlorella sp. M-12前、后，其内部菌丝形态的扫描电镜如图3(a)~图3(c)所示。可以看出，收获藻细胞前的黑曲霉菌丝球为致密的球状物，其结构较为完整，菌丝表面光滑，菌丝球内部的菌丝相互缠绕并交织成致密的网状结构。这种结构使菌丝球具有较高的比表面积，为微藻的吸附提供了较高的吸附容量与结合点位。由图3(d)可以看出，收获Chlorella sp. M-12后的黑曲霉菌丝球内外部及菌丝上附着有藻细胞。李祎等^[12]及BARROS等^[26]的研究表明，真菌收获微藻主要通过直接与间接絮凝2种方式进行。其中，直接絮凝是真菌的菌丝球通过网捕卷扫将藻细胞黏合在一起，从而形成大体积的沉降物。本研究进一步验证了此结论，即菌丝的完整性可能是提高絮凝效果的重要原因。

图4与图5分别为经过不同处理后Chlorella sp. M-12收获率及菌藻成球外观状态。由图4可知，Chlorella sp. M-12收获率由高到底顺序为：EPS+完整菌丝球(96.0%)>失活EPS+完整菌丝球(90.6%)>EPS+无菌丝球(28.8%)>失活EPS+破碎菌丝球组(7.0%)，且各组之间差异显著。因此，可以推测，黑曲霉菌丝球的网捕卷扫作用与EPS的电荷中和的共同作用获得了较高的Chlorella sp. M-12收获率。其中，完好菌丝球的网捕卷扫作用在收获Chlorella sp. M-12中占主导：在EPS失活条件下，只存在完整的菌丝球时，Chlorella sp. M-12的收获率虽然有下降，但仍然达到91%；而无菌丝球或者菌丝球被破坏时，Chlorella sp. M-12的收获率分别下降到28.8%和7.0%，比空白组分别降低了67.2%以及89.0%。另外，由上述结果可知，EPS对 Chlorella sp. M-12的收获起次要的作用：当只有EPS存在时，Chlorella sp. M-12的收获率为28.8%。这说明，真菌的菌丝球通过分泌带有不同电荷属性的蛋白质、多糖等物质，利用电中和特性，最终可使藻细胞聚集并絮凝沉降。

1)高含油小球藻Chlorella sp. M-12对猪粪沼液中$ {\rm{NH}}_4^{+}$-N与TP的去除率可分别高达84.2%与100%；营养回收方面，每消耗1 g的$ {\rm{NH}}_4^{+}$-N可生产4.3 g的微藻干物质。这表明，Chlorella sp. M-12具有较强的氮磷吸收潜力。

2)黑曲霉菌丝球能高效收获能源微藻Chlorella sp. M-12，其最佳收获条件为：菌藻干重比为1∶1、初始pH为6.0、培养温度为28 ℃，转速为180 r·min⁻¹。在最佳条件下，Chlorella sp. M-12收获率可在1 h内达90%以上。

3)黑曲霉菌丝球结构的完整性产生的网捕卷扫与EPS的共同作用是实现高效Chlorella sp. M-12絮凝收获的重要原因。其中，菌丝球的网捕卷扫的功能占主导作用，其次为菌丝球分泌的EPS的电荷中和作用。