实验所用菌株为实验室筛选得到的SRB，使用改良的Postgate C培养基(0.5 g·L⁻¹ KH₂PO₄，1.0 g·L⁻¹ NH₄Cl，1.0 g·L⁻¹ NaSO₄，0.1 g·L⁻¹ CaCl₂·2H₂O，2.0 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O，2.0 g·L⁻¹ DL-乳酸钠，1.0 g·L⁻¹ 酵母提取物，1.0 g·L⁻¹ Resazurin，0.5 g·L⁻¹ FeSO₄·7H₂O，0.1 g·L⁻¹ 巯基乙酸钠，0.1 g·L⁻¹ 维生素C，pH为7.8，121 ℃灭菌15 min)以10 %的接种量接入菌株，在100 mL厌氧瓶中于37 ℃恒温培养箱中对SRB进行培养。当菌液中产生大量黑色沉淀物后即可进行后续实验。

在氮气气氛下，在含有0.2 mol·L⁻¹的FeSO₄·7H₂O溶液的三口烧瓶中逐滴加入0.4 mol·L⁻¹的NaBH₄溶液，室温条件下，使用磁力搅拌器混合均匀。反应过程中亚铁可被还原为Fe⁰(式(1))，从而合成得到Fe⁰纳米粒子^[18]。使用去离子水冲洗3次Fe⁰纳米颗粒，将湿Fe⁰纳米颗粒与0.03 mol·L⁻¹的六水硫酸镍反应，制备得到镍铁双金属纳米颗粒(式(2))。用乙醇和去离子水分别冲洗纳米粒子清除多余的SO₄²⁻和Na⁺离子，再真空冷冻干燥24 h。

1)活性生物微球(SSNF)的制备：取2.0 g海藻酸钠加入70 mL去离子水中加热搅拌至溶解，高压灭菌后冷却至室温，加入30 mL的菌液(菌数量约为4.18$ \times {10}^{4} $个·mL⁻¹)，分别加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g镍铁双金属纳米粒子，不断搅拌，用针筒逐滴加入到含有2 %CaCl₂的溶液中，形成1~2 cm的圆球，在37 ℃恒温培养箱中硬化10 h后，用去离子水多次清洗小球，4 ℃保存备用。

2)海藻酸钠+硫酸盐还原菌微球(SS)的制备：取2.0 g海藻酸钠加入70 mL去离子水中加热搅拌至溶解，高压灭菌后冷却至室温，加入30 mL的菌液，不断搅拌，用针筒逐滴加入到含有2%CaCl₂的溶液中，形成1~2 cm的圆球，在37 ℃恒温培养箱中硬化10 h后，用去离子水多次清洗珠子，4 ℃保存备用。

3)海藻酸钠微球(S)的制备：取2.0 g海藻酸钠加入100 mL去离子水中加热搅拌至溶解，高压灭菌后冷却至室温，用针筒逐滴加入到含有2%CaCl₂的溶液中，形成1~2 cm的球形，硬化10 h后，用去离子水多次清洗珠子，4 ℃保存备用。

将制备的SSNF、SS、S微球分别取5.0 g加入到50 mL，含300 mg·L⁻¹ Cd²⁺的合成液(0.5 g·L⁻¹ KH₂PO₄，1.0 g·L⁻¹ NH₄Cl，1.0 g·L⁻¹ NaSO₄，0.1 g·L⁻¹ CaCl₂·2H₂O，2.0 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O，2.0 g·L⁻¹ DL-乳酸钠，0.5 g·L⁻¹ FeSO₄·7H₂O，0.1 g·L⁻¹ 巯基乙酸钠，0.1 g·L⁻¹ 维生素C)厌氧瓶中，恒温振荡(37 ℃，180 r·min⁻¹)，分别在第1、2、3、4、5、6、7 d取样；溶液通过0.45 μm滤膜过滤，测定反应前后溶液中Cd²⁺和SO₄²⁻浓度变化。计算吸附量。实验均设置3组平行。

通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-5000)测定反应前后溶液中Cd²⁺浓度变化；通过电感耦合原子发射光谱仪(ICPS-7500)测定反应前后溶液中S元素的变化。Cd²⁺浓度和S元素前的测定需将溶液通过0.45 μm滤膜过滤后进行测定。使用流式细胞仪(BD Accuri C6 Plus，Flow Cytometer)测定菌液中菌的数量。使用溴化钾压片法对反应前后的SSNF进行傅里叶红外光谱(Spectrum Two )分析表征；扫描电镜(JSM-IT500)对反应前后的SSNF，镍-铁和SRB的表面的形貌进行分析；采用X射线衍射图谱(D8 Advance, Bruker, Karlsruhe)分析SSNF反应前后体系的变化。实验样品需预先用去离子水冲洗，真空冷冻干燥后进行傅里叶红外光谱、扫描电镜和X射线衍射图谱分析。

分别取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g 镍-铁制备活性生物微球，然后分别取5.0 g小球分别加入到50 mL含有不同质量梯度的Cd²⁺(100、200、300、400、500 mg·L⁻¹)合成液的厌氧瓶中，通过使用HCl或NaOH调节pH至4、5、6、7、8、9，恒温振荡(37 ℃，180 r·min⁻¹)，并分别在第1、2、3、4、5、6、7 天时取样，溶液过0.45 μm滤膜过滤，使用电感耦合等离子体发射光谱仪测定反应前后 Cd²⁺浓度。计算吸附量。实验均设置3组平行。

通过3个实验周期测定活性生物微球重复使用的可行性。测试均在最佳条件下进行。活性生物微球在pH为7、50 mL Cd²⁺(300 mg·L⁻¹)合成液的厌氧瓶中，恒温振荡(37 ℃，180 r·min⁻¹) 5 d后，微球经过滤分离后，用无菌生理盐水振荡洗涤1 h，再放入富集培养基中激活12 h后进行下一周期实验。如此重复3次，并计算重复使用后活性生物微球对Cd²⁺和SO₄²⁻的去除率。实验均设置3组平行。

SSNF对Cd²⁺的吸附动力学分析：取5.0 g SSNF微球(镍-铁加入量为0.3 g)加入到pH为7，50 mL的300 mg·L⁻¹ Cd²⁺合成液的厌氧瓶中，37 ℃下恒温振荡(180 r·min⁻¹)，分别在第1、2、3、4、5、6、7 天取样。溶液通过0.45 μm滤膜过滤，通过电感耦合等离子体发射光谱仪测定反应前后Cd²⁺浓度，分析其动力学特征。采用准一级动力学方程(式(3))和准二级动力学方程(式(4))分析实验数据，再进一步使用颗粒内扩散模型方程(式(5))分析吸附机理^[19]。

式中：q_t为某时刻的吸附量，mg·g⁻¹；q_e为平衡时的吸附量，mg·g⁻¹；t为吸附时间，d；k₁为准一级动力学模型速率常数，d⁻¹；k₂为准二级动力学模型速率常数，g·(mg·d)⁻¹；k_p为颗粒扩散速率，mg·(g·d^1/2) ^-1；C为厚度、边界层的常数，mg·g⁻¹。

不同微球对Cd²⁺的吸附量随时间变化如图1(a)所示。在不同微球间存在显著差异。其中SSNF对Cd²⁺的最大吸附量达到80.40 mg·g⁻¹ ，高于SS(74.79 mg·g⁻¹)和S(50.99 mg·g⁻¹)。但当初始Cd²⁺含量为400 mg·g⁻¹时，SSNF对Cd²⁺的最大吸附量达到103.86 mg·g⁻¹ ，高于SS(90.6138 mg·g⁻¹)，具有显著差异。这是由于SRB可以将硫酸盐还原成硫化氢，硫化氢与Cd²⁺形成CdS沉淀^[8]。反应过程如式(6)和式(7)所示。

式中，CH₂O是有机物，M是重金属离子。镍-铁具有促进SRB与重金属反应的作用。Fe⁰在厌氧条件下很容易在水中氧化生成H₂(式(8))，从而提供电子促进SRB还原硫酸盐((式(9)和式(10))。当Ni⁰与Fe⁰偶联时，Ni⁰可作为原电池的负极，从而加速电子转移^[20]。式(11) 是基于式(8)和式(10)得到的。镍-铁对SRB具有协同促进作用，使得SSNF相较于SS和S处理废水中的Cd²⁺更具优势。

硫酸根浓度可作为SRB活性的参考指标。由图1(b)可见，硫酸根浓度随时间的变化呈先下降后稳定的趋势。这是由于SRB对Cd²⁺的吸附起主要作用，金属的快速吸附不仅取决于细菌细胞表面的物理吸附和镍-铁与Cd²⁺的化学反应，海藻酸钠对Cd²⁺也具有一定的吸附能力。以上结果表明，SSNF对Cd²⁺具有很好的去除能力，因此，选择SSNF进行后续实验。

1) FTIR表征分析。图2为SSNF与Cd²⁺反应前后的FTIR光谱图。在3 434~3 435 cm⁻¹处的特征峰为蛋白质的-NH基团和葡萄糖的羟基基团 ^[21]。在2 972~2 974 cm⁻¹和621~592 cm⁻¹处观察到是CH₂的不对称伸缩振动，与蛋白质中的烷基和海藻酸钠的脂肪酸或CH₂基团相对应^[22]。1 629~1 627 cm⁻¹处的峰可能是蛋白质或胺的C=O伸缩振动。在1 420~1 380 cm⁻¹附近的强峰表明羧基的存在，其弯曲振动与C=O基团一致。1 088~1 091 cm⁻¹处的峰是多糖的C—O伸缩振动。结果表明，SSNF的特征峰伸缩位于1 420、1 629和3 435 cm⁻¹附近，当SSNF处理Cd²⁺溶液后，FTIR光谱图中相应的峰发生了强度变化或位移。红外光谱从1 380 cm⁻¹到1 420 cm⁻¹有明显的峰强度变化，表明羧基上的C=O参与了SSNF与Cd²⁺的反应。峰从1 627 cm⁻¹到1 629 cm⁻¹表明海藻酸钠或SRB中蛋白质或胺基参与了Cd²⁺的反应。位于3 434 cm⁻¹的峰强度增强，表明海藻酸钠或SRB中羟基和胺基参与了Cd²⁺的反应^[23]。因此，可以合理地假设海藻酸钠和SRB中羧基、羟基、胺基是与Cd²⁺结合的主要官能团。

2) SEM分析。由图3(a)可见，因镍-铁具有磁性，故呈串珠状结构^[24]，尺寸为80~100 nm。由图3(b)可见，SRB呈棒状结构，尺寸为2~3 μm。对比图3(c)和图3(d)可以看出，在与Cd²⁺反应前，SSNF表面粗糙，具有较大的比表面积，且SRB含量较少；SSNF与Cd²⁺反应后表面孔隙减少且产生大量的不规则沉淀，镍-铁周围的SRB含量显著增多。由此可推测，沉淀物是通过镍-铁与SRB的氧化还原作用产生的CdS、Fe₃O₄和Fe₂O₃^[25]。海藻酸钠可以保护SRB的活性，降低Cd²⁺对其产生的毒性；同时，镍-铁可以制造适宜SRB生长的厌氧环境，使其可以在SSNF表面大量生长，从而实现SSNF对高浓度Cd²⁺的去除。

3) XRD分析。图4中JCPDS 37-0474为镍-铁的标准卡片，JCPDS 10-0454为CdS的标准卡片。由图4可见，反应前的样品有1个最明显的特征峰在44.74°，属于镍-铁的(110)衍射晶面。反应后在27.31°、44°和81.09°有3个明显的特征峰，分别属于CdS的(111)、(226)和(422)衍射晶面。这表明SRB可将溶液中的SO₄²⁻还原为S²⁻，使溶液中Cd²⁺转化为CdS沉淀，且在反应后镍-铁的特征峰峰高变低。这说明反应后样品中镍-铁的量降低，推测可能产生Fe₃O₄或Fe₂O₃^[18]。以上结果表明，SSNF处理含Cd²⁺废水发生了氧化还原和共沉淀，溶液中Cd²⁺最终以CdS沉淀的形式被去除。

1)镍-铁添加量对SSNF去除Cd²⁺能力的影响。在Cd²⁺初始质量浓度为300 mg·L⁻¹、pH为7、反应时间为5 d时的反应条件下，通过添加不同质量的镍-铁制备SSNF微球，考察了其对Cd²⁺去除能力的影响。由图5(a)可见，SSNF对Cd²⁺的去除率随镍-铁添加量的增加呈先增加后减少的趋势。当镍-铁添加量由0增加到0.3 g时，SSNF对Cd²⁺的去除率由75.79%增加到99.41%；当继续增加镍-铁时，SSNF对Cd²⁺的去除率却呈下降的趋势。由此可确定SSNF中镍-铁的最佳添加量为0.3 g。其原因可能是：当镍-铁添加量过少时，其对SRB处理Cd²⁺的协同促进作用较小，SRB生长密度过大，导致SRB对营养物质的竞争，从而阻碍微生物生长，降低SSNF对Cd²⁺的去除效果；此外，由于镍-铁具有磁性，会产生团聚现象^[25]，所以当镍-铁的添加量过多时，会包裹在SRB的表面，减少了SRB与硫酸盐的接触面积，影响微生物的正常生长，从而降低了SSNF对Cd²⁺的去除率。

2)反应时间对SSNF去除Cd²⁺的影响。在Cd²⁺初始质量浓度为300 mg·L⁻¹、pH为7、SSNF微球中镍-铁添加量为0.3 g时，SSNF对Cd²⁺的去除率随时间变化如图5(b)所示。可以看出，SSNF对Cd²⁺的去除率呈先增加，然后趋于平衡的变化特征。其吸附过程分为2个阶段：0~1 d为快速去除阶段，去除率达到77.53%；2~5 d为慢速去除阶段，在第5 d基本达到平衡，去除率达到99.98 %。0~1 d时，由于镍-铁具有促进SRB还原硫酸盐的作用， SSNF微球具有足够的反应位点，使其达到快速去除Cd²⁺的效果；1~5 d时，SRB进入对数生长期和稳定期，由于重金属的毒性作用使得部分菌死亡，而有研究证明，死菌对Cd²⁺的去除能力显著低于活菌^[8]，导致SSNF对Cd²⁺的去除率增长缓慢；5~7 d时，SRB进入衰亡期，镍-铁由于在反应过程中发生氧化反应导致其还原能力下降^[18]，所以SSNF对Cd²⁺的去除率基本趋于平衡。因此，SSNF与Cd²⁺反应的最佳平衡时间为5 d。

3) pH对SSNF去除Cd²⁺的影响。在Cd²⁺初始质量浓度为300 mg·L⁻¹、反应时间为5 d时、镍-铁添加量为0.3 g时，不同pH对SSNF去除Cd²⁺的影响结果见图5(c)。可见，随pH的增加，SSNF对Cd²⁺的去除率呈先增大后减小的趋势。当pH为4~7时，去除率由88.59%增大到99.31%；当pH为7~9时，去除率由99.31%减小到97.21%。由此可知，当pH为7时，SSNF对Cd²⁺的去除效果最好。这可能与溶液中的离子与相应的官能团的静电结合作用有关。在较高pH条件下，SSNF对Cd²⁺的去除能力高于较低pH条件下，因为在较低pH条件，溶液中H⁺含量较高，其会与Cd²⁺竞争SSNF的反应位点，同时H⁺会与SSNF表面的-OH基团结合形成-OH₂⁺，从而使SSNF表面官能团带正电，从而减少SSNF与Cd²⁺的反应位点^[26]。当溶液pH为9时，Cd(OH)₂的浓度商大于溶度积常数，说明溶液中存在Cd(OH)₂沉淀，所以此时的去除率相较于pH为8时有所提升。在较高pH条件下，SSNF表面的-OH被电离成带负电的氧(−O–)，其可排斥能够吸附Cd²⁺的SSNF上的带负电的基团 ^[18]，从而降低SSNF对Cd²⁺的去除能力。

4) Cd²⁺初始浓度对SSNF去除Cd²⁺的影响。在SSNF中镍-铁添加量为0.3 g、反应时间为5 d、pH为7时，考察了不同的Cd²⁺初始浓度对SSNF去除能力的影响。如图5(d)所示，随着Cd²⁺浓度的增加，其去除率呈先平稳后下降的趋势。当Cd²⁺质量浓度为100~400 mg·L⁻¹时，SSNF对其的去除率几乎达到100%，其最大吸附量达到103.86 mg·g⁻¹；当Cd²⁺质量浓度为500 mg·L⁻¹时，SSNF对其的去除率下降至95.25%。当Cd²⁺浓度较低时，SSNF具有足够的反应位点，且容易与Cd²⁺结合^[27]，此外，镍-铁可制造SRB适宜生长的厌氧环境，从而形成较高的Cd²⁺去除率。当Cd²⁺浓度过高时，SSNF的反应位点逐渐饱和^[28]，且高浓度的Cd²⁺会对SRB产生毒性作用，干扰核酸和酶活性位点，SRB的生长受到抑制，导致SSNF对Cd²⁺的去除率下降^[29]。

活性生物微球经过3次循环再利用后，对Cd²⁺的去除率和SO₄²⁻的消耗情况如图6所示。SSNF对Cd²⁺始终保持较高的去除率，而SO₄²⁻的消耗较最初仅降低了4.4 %。在每个周期结束后，使用硫酸盐还原菌培养基激活SRB，SSNF在下1个周期仍能对Cd²⁺保持较高的去除能力。这说明，活性微球可以保护SRB，从而降低Cd²⁺对其产生的毒性作用，同时，不易被氧化的镍-铁仍可促进SRB与Cd²⁺发生还原反应，从而保持较高的去除能力。在第1个周期后，微球没有发生断裂；但在后2个周期中，微球发生部分断裂，可能造成微珠内的物质泄露，从而降低活性微球对Cd²⁺和SO₄²⁻的去除率。同时，3个周期实验中释放的Ni质量浓度均小于1 mg·L⁻¹。由此可见，SSNF具有良好的循环再利用性能。

由图7(b)、图7 (c)和表1可以看出，SSNF对Cd²⁺的吸附更加符合准二级动力学。其准一级动力学模型和准二级动力学模型的R²分别为0.914和0.998，均大于0.9，但准二级动力学方程所得的理论平衡吸附量q_e(88.50 mg·g⁻¹)相比于准一级动力学方程所得的理论平衡吸附量q_e(43.14 mg·g⁻¹)更加接近实验所得吸附量(80.40 mg·g⁻¹)，说明SSNF对Cd²⁺的吸附主要受化学吸附控制，而物理吸附作用为辅^[19]。颗粒内扩散模型的拟合曲线未通过原点，说明吸附过程不符合颗粒内扩散模型，其吸附过程受其他吸附阶段的共同控制。这可能是因为吸附过程是通过离子交换或共价电子对形成的共价力即化学吸附起主要作用。SRB还原硫酸盐产生的硫化物与重金属形成的金属硫化物沉淀是发生在SSNF外部，所以重金属离子不易进入SSNF内部^[24]。所以，SSNF对Cd²⁺的吸附过程为：第1步是硫酸盐扩散，被SSNF中的SRB还原生成硫化物；第2步是硫化物与Cd²⁺形成金属硫化物，沉淀到SSNF表面。

1) SSNF对废水中高浓度的Cd²⁺具有较好的去除能力，镍-铁对SRB具有协同促进作用。SSNF吸附Cd²⁺的最佳条件为：镍-铁添加量为0.3 g，pH为7，反应时间5 d，Cd²⁺初始质量浓度为400 mg·L⁻¹.此时Cd²⁺的去除率达到100%，吸附量为103.86 mg·g⁻¹。

2) SSNF与Cd²⁺反应前后物质组成的变化说明：反应过程中存在离子交换作用，羧基、羟基、胺基是与Cd²⁺结合的主要官能团，溶液中的Cd²⁺转化为CdS沉淀的形式被去除。

3) SSNF吸附Cd²⁺符合准二级动力学模型，以化学吸附作用为主，物理吸附为辅；离子交换或共价电子可能是SSNF去除Cd²⁺的主要机制。