由病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)致使的棉花黄萎病造成了棉花的严重减产甚至绝收,危害了全国棉花生产业的发展,是棉花病虫害中危害最严重的土传病害,被称为“棉花的癌症”[1]。并且由于我国棉花的种植地域和种植方法的单一,随着耕作时间的延长,使得大丽轮枝菌导致的棉花黄萎病的危害性也在不断加重[2-4]。目前在棉花的生产中用于防治棉花黄萎病的方法主要有作物轮作法、培养抗性品种法、化学农药法、生物防治以及综合防治法。而随着绿色经济的发展,利用生防菌和生防菌的抑菌代谢产物来进行生物防治的绿色防控技术已逐步成为农业生产中的研究热点[5]。针对植物土传病害的生物防治主要就是通过筛选出自然界中存在的有益微生物,利用生防菌的菌体本身或其代谢产物的直接作用防治各种植物病原菌[6],或者是通过改变土壤中微生物的群落结构以此来防治植物病害[7]。目前在防治棉花黄萎病上应用较多的生防菌就是芽孢杆菌和假单胞菌等生防菌[8-9]。例如李芮[9]的相关专利中,发现假单胞菌841P-3对棉花黄萎病有着极其显著且绿色安全的防治效果;胡彦婷[10]通过基因组测序,发现枯草芽孢杆菌BSD-2能够分泌如脂肽、Tas A及溶素等多种抑菌代谢产物,以此来高效抑制棉花黄萎病病原菌的生长。

随着各类生防菌剂的逐渐成熟,许多生防菌剂都在逐渐应用到农田和温室大棚中。但是并非所有天然来源的生防菌剂都是安全无害的,仍有部分的生防菌剂是存在一定毒性的,因此需要进行生防菌剂的安全性评价。同时虽然目前发现的大部分生防菌剂都来源于田间土壤或者植物本身,但是在施用生防菌剂进行防治的过程中以人为的形式将大量外源的生防菌剂施入到田间土壤,很有可能会不同程度影响到土壤原有的微生物群落结构和生态功能,并对土壤稳定的微生态系统产生一定影响[11]。而土壤微生物中细菌作为含量最多、作用强度和影响最大的微生物,在土壤中起着十分重要的作用[12]。在土壤环境发生变化的同时,细菌群落结构的多样性及丰富度就会受到影响,而土壤中细菌群落结构的多样性及丰富度与植物真菌病害的发生关系密切[12]。尹丹韩等[13]研究发现施入生防菌哈茨木霉T4的发酵液后会对黄瓜根际周围的土壤细菌群落产生显著影响,并持续一段时间。李全胜等[14]研究发现施用水分散粒剂H14可以提高棉花棉田土壤细菌群落的物种丰富度和多样性,增加有益菌属的相对丰度,有利于棉花的健康生长。因此在应用生防菌剂前必须对生防菌剂对土壤中细菌微生态的潜在影响展开相应研究。

目前,筛选并分离能够拮抗棉花黄萎病病原菌的菌株和抑菌物质的研究较多,但对患病的棉花棉田土壤施用生防菌次生代谢产物后,通过观察土壤中细菌群落结构变化,来揭示抑菌物质安全性的研究还较为少见。枯草芽孢杆菌J-15是由本实验室筛选获得的1株可以高效拮抗棉花黄萎病病原菌的生防细菌[15],后期通过对其发酵液的分离纯化,制备出了其次生代谢产物。利用其代谢产物能高效拮抗棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌,吴梦君等[16]的实验证实该菌株在实验室盆栽条件下对棉花黄萎病有着良好的生防作用,可以作为棉花黄萎病生物防治的抑菌物质。而枯草芽孢杆菌J-15虽然具有良好的生物防治潜能,但是其次生代谢产物却又可能具有一定的细胞毒活性,并对土壤微生物产生危害。因此本研究以不施菌剂的清水组作为对照组,以施用枯草芽孢杆菌J-15次生代谢产物(secondary metabolites of Bacillus subtilis J-15, SMs)粗提液作为处理组,采用Illumina HiSeq测序平台,分析SMs粗提液对土壤中细菌群落的影响,以期作为评价该次生代谢产物对土壤微生物安全性的一条依据,为利用SMs进行棉花黄萎病的生物防治提供理论指导和依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 菌株及主要试剂

枯草芽孢杆菌J-15[15]由本实验室从患病棉花棉田土壤筛选得出并保存,其次生代谢产物提取自本实验室自主筛选得出的枯草芽孢杆菌J-15。

土壤微生物DNA提取试剂盒为康维世纪的Soil DNA Kit试剂盒。

1.2 J-15次生代谢产物粗提液的制备

采用平板划线法分离纯化出枯草芽孢杆菌J-15的单菌落,挑取其单菌落接种于20 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中,培养至对数生长期,制备其种子液。将种子液以1%接种量转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基中,培养18 h,得到其发酵液。以4 ℃、12 000 r·min-1条件,离心30 min后,弃去菌体沉淀,取上清。将J-15上清液用浓盐酸将其pH值调节至1.5,置于4 ℃冰箱过夜。再以4 ℃、12 000 r·min-1的条件,离心30 min后,弃上清,取沉淀,并将沉淀溶解在一定量的无菌水中,调节pH值至7,所得溶液用4倍体积的冰浴丙酮抽提3 h,离心除去沉淀,取上清,旋转蒸发。所得溶液氯仿萃取3 h后取上层水相,旋转蒸发残余氯仿,最后通过0.22μm无菌滤膜过滤获得SMs粗提液,并冷冻干燥。以无菌水为溶剂,配制0.33 mg·mL-1 SMs溶液备用[17]。

1.3 土壤样品的采集

从新疆玛纳斯实验棉田采样。采样方法选用随机取样法,随机挑选5个点采样,采集0～20 cm厚度的土层,采样时需避开棉花根际,采样后将样品充分混合,存于密封袋中带至实验室。使用2 mm的土壤筛除杂质。

1.4 土壤样品的处理

试验分别设置两个大组。处理组(SMs):添加100 mL 0.33 mg·mL-1 SMs粗提液至土壤,达到其最大含水量;对照组(CK):添加等量的灭菌后的去离子水。土样均为100 g,置于室温黑暗培养,以此模拟SMs溶液在大田中的试验情况。实验培养的过程中采取称重法定期测量土壤中的含水量,保持2个组中的土壤含水量相同,分别在10、30和60 d时,采用三点垂直取样法取样,并将取样土壤充分混合备用。处理组分别命名为SMs-0、SMs-10、SMs-30和SMs-60,每组均设3次重复;对照组分别命名为CK-0、CK-10、CK-30和CK-60,每组均设3次重复。

1.5 土壤微生物DNA的提取

利用康维世纪的Soil DNA Kit试剂盒,参照其说明书提取土壤DNA。土壤样品的DNA提取完成后,以电压100 V、时间40 min的条件,采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6 16S rDNA基因的PCR扩增

以提取的土壤DNA为PCR模板,扩增细菌的16S rDNA区域,引物(338F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’,806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[18]。PCR的扩增程序:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性30 s,50 ℃复性30 s,72 ℃延伸5 min,共计30个循环[19]。在检测过8组土壤样品的PCR产物后,送至北京百迈克公司进行高通量测序。

1.7 数据处理与分析

利用Illumina HiSeq的高通量测序平台,通过PCR扩增产物构建出测序文库并质检,对质检合格的测序文库进行高通量测序。将高通量测序得到的原始数据转化为原始的测序序列。对测序获得的原始测序序列进行预处理,首先使用Trimmomatic v0.33软件,对原始测序序列中的Raw Reads进行过滤;然后使用cutadapt 1.9.1软件去除引物序列,得到高质量Reads;然后使用FLASH v1.2.7软件,拼接土壤样品中高质量的Reads,得到优化序列,最后使用UCHIME v4.2软件,去除优化序列中的嵌合体。

利用北京百迈克公司提供的百迈克云平台对最终有效的测序数据进行OTU聚类、物种注释、丰度分析,以此来揭示对照组和实验组中物种的组成,再进一步通过Alpha多样性分析(Alpha diversity)、Beta多样性分析(Beta diversity)和群落结构分析[20]等,分析对照组和处理组样品之间的差异。利用SPSS软件和Sigma Plot 12.0软件进行数据分析和图片制作。

2 结果(Results)

2.1 土壤细菌测序信息

根据高通量测序土壤样品共测得1 680 362对Reads,其中经过质检筛选、拼接过滤以及去除引物序列后共产生1 436 797条优化序列,优化序列去除嵌合体后的最终有效序列数为1 412 445条,其中单个样品获得的优化序列数至少为667 44,平均产生68 419条优化序列。如表1所示,所有的土壤样品有效率均在83%以上。有效序列的平均长度分布在418～420 bq之间,且在419 bq分布最多。测序质量值Q20皆>96%,Q30皆>94%,表明测序质量较高,测序数据准确。

2.2 OTU聚类分析结果

8组土壤样品覆盖率均>99.8%(表2),说明本次测序可以较为全面地反映出土壤细菌群落多样性和丰富度。在序列相似度为97%的水平上划分出分类单元(OTUs),共获得1 670个OTUs。全部OTUs共划分为27个门,85个纲,129个目,232个科,422个属,330个种。韦恩图(Venn) (图1)直观地表示了对照组(CK)和处理组(SMs)之间土壤细菌群落的OTUs数目以及2组之间的相似性和特异性。CK和SMs的土壤样本分别检测到1 657和1 641个OTUs,其中共有的OTUs数目为1 628个,共有的OTUs在CK中占98.25%,在SMs中占99.21%,说明CK和SMs中优势菌门相似。但是CK特有OTUs个数(29个)多于SMs(13个),说明加入SMs会使细菌群落差异减小。

2.3 细菌Alpha多样性分析

通过比较Chao1、Ace、Shannon、Simpson等多种Alpha多样性指数,反映了对照组和处理组共8组土壤样品的物种丰富度及物种多样性。Chao1指数反映的是样品中所含OTUs数目,其指数越大说明样品中所含物种越多。Ace指数反映的是样本中物种组成的丰富度和均匀度,其指数越大表示该环境的物种越丰富,各物种分配越均匀[21]。而Shannon指数则是用来估算样品中微生物的多样性指数之一,Shannon值越大,说明群落多样性越高。

Simpson指数反映的则是优势种在群落中的地位和作用,若一个群落中优势种占的多,其他非优势物种所占的比例则会减少,所以Simpson指数值较大,则说明群落多样性较低,该指数与其他多样性指数均呈负相关,即Shannon指数越大时,Simpson指数就会越小[22]。如表2所示,8组土壤样品中Chao1指数和Ace指数都较大,说明8组样品中的细菌群落皆有较高的丰富度。且8组土壤样品的Shannon指数都较大,Simpson指数都较小,说明8组样品中细菌群落皆有着较高的多样性。但比较对照组和处理组的Alpha多样性指数,发现SMs处理土壤不同时间后Shannon、Simpson、Chao1和Ace指数均与对照组无显著差异,说明SMs对土壤中细菌群落的丰富度和多样性无显著影响,即SMs的施用没有显著改变土壤细菌的丰富度和多样性。

2.4 细菌Beta多样性分析

Beta多样性分析比较的是不同生态系统之间多样性,也就是样品间的差异,是通过利用各样本之间优化序列间的序列距离来计算样本间距离,以此反映样本间是否具有显著的群落差异[23]。根据PCA主成分分析结果(图2)可看出,主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分别占比47.81%和22.88%,0 d与其他时间阶段相比,两者在坐标轴上的距离较远,说明0 d与其他时间段的细菌群落结构差异较大;除此之外SMs处理土壤不同时间后的处理组与其对照组在坐标轴上距离都比较接近,说明SMs处理土壤不同时间后的处理组与其对照组的细菌群落结构相似性都较高,即施用SMs没有显著改变土壤细菌的群落结构。

同时利用置换多元方差分析,根据样本间的Binary Jaccard距离,分析了对照组与SMs处理组的组间组内差异解释度,并使用置换检验进行显著性统计。根据置换多元方差分析的分析结果(图3)可知,对照组与SMs处理组之间没有显著性差异,说明加入SMs并不会显著改变土壤细菌的群落结构。除此之外,处理组的组内差异小于对照组的组内差异,说明了加入SMs可以使细菌群落差异减小,与OTUs聚类分析的结果相同。

2.5 SMs处理土壤不同时间对细菌群落结构的影响

2.5.1 门水平的群落结构分析

应用统计学方法对土壤样品中的细菌进行门水平上的群落结构分析,如图4所示,8组土壤样品中排名前十的土壤细菌群落的主要门皆是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)。其中在8组土壤样品中变形菌门的相对丰度均占有绝对优势,平均相对丰度为46.60%。除此之外,酸杆菌门和拟杆菌门在8组土壤样品中的平均相对丰度也皆>10%,平均相对丰度分别为13.83%和12.76%。SMs处理土壤10、30和60d后,变形菌门和硬壁菌门的相对丰度相较于对照组皆有上升趋势,拟杆菌门、绿弯菌门和放线菌门相较于对照组则有下降趋势,但差异均不显著。其余主要门的相对丰度有所变化却影响不大。说明SMs处理土壤后对土壤中的细菌群落结构有一定影响但不显著。

2.5.2 属水平的群落结构分析

应用统计学方法对土壤样品中的细菌属水平上的群落结构分析,如图5所示,8组土壤样品中排名前十的土壤细菌群落的主要属皆为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、芽单胞菌科(uncultured bacterium_f_Gemmatimonadaceae)、蒂莫内马赛菌属(Masilia)、噬几丁质菌科(uncultured bacterium f_Chitinophagaceae)、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、砂单胞菌属(Arenimonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、RB41、芽孢杆菌属(Bacillus)。其中鞘氨醇单胞菌属的相对丰度在8组土壤细菌样品中均占有绝对优势,平均相对丰度为10.94%。除此之外SMs处理土壤10 d和30 d后,黏球菌属、蒂莫内马赛菌属和噬几丁质菌科的相对丰度相较于对照组略有下降,而假单胞菌属和芽孢杆菌属的相对丰度相较于对照组则有所上升,但差异均不显著。其余主要属的相对丰度有所变化,但变化幅度不大。再次说明了SMs处理土壤后对土壤中的细菌群落结构有一定影响但不显著。与门水平上的细菌群落分析结果趋于一致。

由图5可知,鉴定出的结果中排名前十且相对丰度(>1%)的属中有未鉴定出的属,也占有一定的比例,它们分别为芽单胞菌科中的一属、噬几丁质菌科中的一属以及细菌中的一属,这表明土壤样品中可能存在一部分细菌的新类群。

2.6 SMs处理土壤不同时间细菌聚类分析

选取丰度排名前二十的属按照上述8组样品的分组情况进行各样品间细菌物种丰度相似性的聚类分析,生成聚类热图,直观反映了SMs处理土壤不同时间后细菌在属水平上群落组成的相似性和差异性。横坐标代表8组土壤样品,纵坐标表示相对丰度排名前二十的属,聚类分析结果见图6,通过纵向比较可以看出0 d与其他时间阶段相比,0 d时取样的样品优势属较多,物种之间的相对丰度差异较大,其他时间阶段取样的样品优势属较少,物种之间的相对丰度差异较小。通过横向比较可以看出各个时间段样品的优势属各不相同;相同时间段的处理组与对照组,样品优势属的差异性也不大,即SMs处理土壤对细菌群落的多样性和复杂度影响不大。

3 讨论(Discussion)

在施用生防微生物及其代谢产物防治各种植物病害前,通过研究生防微生物及其代谢产物对土著微生物群落的影响,进行初步安全性评价已成为国际共识[24]。土壤是微生物可以健康生长的繁殖场所,因为土壤中含有可以让微生物生长繁殖所需要的一切物质条件,因此有着“微生物的天然培养基”之称[25]。而土壤中的微生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物。它们皆与土壤肥力密切相关,在自然界的物质循环中起着重要作用[26]。土壤越肥沃,微生物种类和数量越多,而土壤中的细菌占土壤微生物总量最多,在土壤微生物中占据着主要地位,其细菌群落的多样性和丰富度则反映了土壤的活性[27-28]。利用两者可有效分析SMs对土壤细菌群落影响,以此评估SMs的安全性。

通过对SMs处理过的土壤样品中的细菌16S rDNA (V3+V4)区域测序分析,根据OTUs聚类分析结果、Alpha多样性和Beta多样性分析结果,可知SMs对土壤中细菌群落的丰富度和多样性均无显著影响。本研究结果与刘雪娇等[29]发现施用贝莱斯芽胞杆菌3A3-15时,对土壤细菌整体的丰富度和多样性没有显著差异的研究结果基本一致。

比较不同时间段下SMs处理土壤细菌主要门相对丰度可知,8组土壤细菌样品中相对丰度较高的前3个门是变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes),且变形菌门的相对丰度在8组土壤样品中均占有绝对优势。在SMs处理土壤10、30和60 d后,变形菌门和硬壁菌门的相对丰度略有提高,而拟杆菌门、绿弯菌门和放线菌门的相对丰度略有下降,但差异均不显著,其余主要门的相对丰度变化则不大。变形菌门属于土壤中的益生菌,可以参与土壤中的物质循环,甚至可以降解土壤中的化学污染[30]。在SMs处理土壤后,其相对丰度的略微上升。这说明SMs处理土壤后对土壤中的细菌群落结构有一定影响但不显著。

由土壤样品中的细菌属分类水平上的群落结构分析可知,鞘氨醇单胞菌属的相对丰度在所有土壤细菌样品中皆占有绝对优势。而研究发现,具有高代谢能力的鞘氨醇单胞菌属,可以通过降解芳香化合物,来保护环境[31]。除此之外绝大多数的假单胞菌属和芽孢杆菌均属于植物根际促生菌,对植物根际吸收土壤元素起着重要作用[32-33]。本研究在8组土壤样品中均检测到了假单胞菌属和芽孢杆菌属,且相对丰度均>1%。同时SMs处理土壤10 d和30 d后,假单胞菌属和芽孢杆菌属相对丰度均有所上升,但差异均不显著。其余主要属的相对丰度有所变化,但变化幅度不大。说明SMs并没有显著影响到农业生产的土壤细菌群落结构,为后期开发利用枯草芽孢杆菌J-15进行农业上生物防治提供了依据。

本研究通过高通量测序技术检测了SMs对土壤细菌群落的影响,结果说明SMs对土壤中细菌群落的丰富度及多样性均无显著影响,且SMs的加入没有显著改变棉花棉田土壤中的细菌群落结构。而谢尔瓦尼木·阿不都艾尼等[34]则分析了SMs处理对棉花致病的病原菌及其他几类植物病原真菌的影响。结果表明,SMs处理后链格孢属(Alternaria)、头束霉(Cephalotrichum)、枝孢属(Cladosporium)、镰孢霉属(Fusarium)、鳞斑霉属(Malassezia)、棉花致病的病原菌轮枝孢属(Verticillium)等植物病原真菌的丰度均下降[34]。因此说明SMs在可以使棉花致病的病原菌及其他几类病原真菌的相对丰度下降的同时,对土壤细菌群落却并无显著影响。说明了SMs在棉花黄萎病的生物防治中可作为生物农药的潜力,可以在农业生产中进一步研究开发利用。本研究结果为利用SMs防治棉花黄萎病提供了一定的理论基础。

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Effects of Secondary Metabolites of Bacillus subtilis J-15 on Soil Bacterial Community in Cotton Fields

You Jia1, Zhao Haoran1, Zhao Jingjing1, Zhang Qi2, Zhang Jingbo1,Meiheri Guri·Mighti1, Li Jinyu1, Hu Jiali1, Zhao Heping2, Gulibahar·Ababakli1,#, Zhao Huixin1,*

1. Xinjiang Special Environmental Species Protection and Regulation Biology Laboratory, School of Life Sciences, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China 2. Beijing Key Laboratory of Resistance Gene Resources and Molecular Development, School of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China

Abstract：Cotton verticillium wilt is one of the leading soil-borne diseases that reduce cotton yield. In the previous work, a strain of Bacillus subtilis J-15 with a strong antagonistic effect against Verticillium dahliae, the pathogen of cotton verticillium wilt, was screened to reveal the effect of the application of secondary metabolites of Bacillus subtilis J-15 (SMs) on the diversity of the bacterial community in cotton field soil. To simulate the application of this metabolite into the soil, pot plants containing Verticillium dahliae were divided into two groups and cultured at room temperature in the dark. 0.33 mg·mL-1 SMs were added to the experimental group to maximize soil water content, while the same amount of deionized water was added to the control group. Samples were taken on days 0, 10, 30, and 60, respectively. The total DNA of soil microorganisms was extracted using the Conway Century’s Soil DNA Kit kit. The bacterial community structure of cotton field soil was analyzed by high-throughput sequencing technology. According to the Alpha diversity analysis, the Shannon index, Simpson index, Chao1, and Ace index of SMs-treated soil were not significantly different from the control group, indicating that SMs had no significant impact on the richness and diversity of the bacterial community in soil. According to community structure analysis, the relative abundance of Proteobacteria and Scleroderma increased slightly after 10, 30, and 60 d of soil treatment by SMs. However, the difference is insignificant. At the genus level, the relative abundance of Pseudomonas and Bacillus increased slightly after 10 and 30 d of SMs treatment. However, the difference is negligible. The results demonstrated that although the application of SMs in soil changed the bacterial community structure in the soil to a certain extent, the effect was insignificant. On this basis, it is concluded that SMs have no substantial impact on the structure and diversity of the soil bacterial community in cotton fields, providing a basis for the development and utilization of Bacillus subtilis J-15 in agricultural biological control.

Keywords：Bacillus subtilis; bacterial community; cotton field soil; high throughput sequencing technology

收稿日期：2022-11-18

录用日期:2023-01-13

文章编号：1673-5897(2023)4-338-11

中图分类号：X171.5

文献标识码：A

基金项目：新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题(2020D0410);国家自然科学基金资助项目(32160074);新疆维吾尔自治区高校科研计划项目(XJEDU2021I023)

第一作者：游佳(1998—),女,硕士研究生,研究方向为应用生物化学,E-mail: 568076499@qq.com

*通信作者(作者(Corresponding author), E-mail: zhaohuixin101@sina.com

#共同通信作者(Co-corresponding author),E-mail: gulbahar.a@163.com

DOI: 10.7524/AJE.1673-5897.20221118002

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Received 18 November 2022

accepted 13 January 2023

通信作者简介:

赵惠新(1975—),女,博士,教授,主要研究方向为生态学。

共同通信作者简介:古丽巴哈尔·阿巴拜克力(1969—),女,硕士,副教授,主要研究方向为植物有效成分分析。