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随着工业化、产业结构的调整和升级，石油已成为不可或缺的一部分，特别是在机械、石油化工、汽车等行业使用量巨大。根据原环境保护部和国土资源部联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》（2014年4月17日）[1]显示，实际调查的630万km2陆地国土中，土壤总超标率为16.1%，有机污染物点位超标率为3.8%，其中多环芳烃点位超标率为1.4%，超标点位主要集中在工业废弃地、工业园区、采油区。同时，我国城市化进程及产业化结构布局的调整，大量污染严重的工厂和企业由中心城区逐步搬迁至工业园区，由此导致搬迁后的废弃工业企业遗留了大量石油烃污染场地，面积高达8000 km²[2-3]，仍需进行修复和生态风险评价。
开展石油烃污染场地对人体健康土壤生态环境的风险毒性评估，可为后期污染场地的修复、风险管控及长期监测提供参考依据[4]。传统的理化分析检测是污染场地调查的常用手段，但存在着土壤中各类污染物测定不完全、不能反映污染物对人类及动植物的毒性效应、对污染物的遗传和代谢等慢性毒性无法追踪等局限性[5]。因此采用生物、生态毒性测试和理化分析相结合的手段来对污染场地进行综合诊断，可用于反映污染物毒性的复杂性、叠加性，并通过生物、生态毒性指标直观反映土壤污染物对人类及环境的影响[6-8]。
为了考察石油烃污染土壤修复前后的毒性效应变化，本研究以斑马鱼胚胎、发光细菌和黑麦草为测试生物，检测了微波热修复15 min前后场地石油烃污染土壤的毒性效应，并采用毒性当量（TU）法对修复前后的石油烃污染土壤进行综合毒性评价，对种植的黑麦草进行生态指标评估，以期为相关石油烃污染场地土壤污染程度调查和修复效果评价提供科学依据。
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供试土壤采自江苏省常州某石油化工厂区的搬迁遗留场地，总占地面积12万 m2（其中重污染厂区面积约5000 m2），主要从事石化产品及润滑油生产，2017年厂区停产并完成搬迁。
土壤样品采自深度0—1 m的生产厂区内，经采集后自然风干、去表杂、破碎后过10目筛（2 mm），测定土壤的pH值（电位法，水土比5 : 1）、含水率（烘干法）、有机质的含量（重铬酸钾容量法-稀释热法）及重金属含量[9]，测定结果：土壤pH值为7.63、含水率5.3%、有机质含量12.38 g·kg−1、锌1.163 mg·kg−1、铅1.0246 mg·kg−1、镍1.8962 mg·kg−1、铜 未检出、铬 未检出，试验土壤为粘土，根据测定土壤总石油烃浓度为5700 mg·kg−1，经过15 min微波热修复后，土壤中残留的总石油烃浓度为2800 mg·kg−1。
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实验试剂：Microtox稀释液、渗透调节液（Mondern Water公司）；费氏弧菌冻干粉（美国SDI生物技术公司）；标准稀释水（HJ 1069-2019配制）
实验仪器：体式显微镜（XTL-850P）；倒置显微镜（IT415 PH）；斑马鱼养殖系统（海圣定制）；生化培养箱（SPX-250B-Z）；超纯水制备仪（Milli-Q Advantage）；DeltaTox 毒性检测仪（DELTATOX）。
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场地石油烃污染土壤浸提液的提取操作主要参考《固体废物浸出毒性浸出方法-水平振荡法》（HJ 557-2010）[10]。以微波处理前场地石油烃污染土壤、未受污染正常土壤（取自实验室附近树林）、微波处理后场地石油烃污染土壤的3种土为研究对象，以纯水作为浸提液进行浸提。制备过程：称取20 g土壤样品于500 mL锥形瓶中，按固液比1∶10（L·kg−1）加入纯水200 mL，瓶口用纱布密封后将其固定在水平恒温振荡箱内（温度25 ℃、频率（110±10）次·min−1），8 h后取下并静置16 h。用0.45 μm微孔滤膜对提取液进行抽滤后，测定其pH值（均为中性），放置于4 ℃冰箱贮存，待毒性测试试验使用。
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试验所用斑马鱼（AB野生型品系）购于湖北省中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心，斑马鱼胚胎的收集方法参考（ISO 15088: 2007）[11]，急性毒性检验方法参照国家标准《水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法》（HJ 1069-2019）[12]。试验设置微波处理前、后污染土壤浸提液的稀释浓度为100%、50%、25%、12.5%、6.25%，未受污染正常土壤的稀释浓度为100%、50%、25%，每个样品设置1组阴性对照、1组阳性对照，阴性对照采用稀释水，阳性对照采用3.7 mg·L−1的3,4-二氯苯胺，每个浓度设置3组平行。在试验中，培养48 h后阴性对照组胚胎存活率不低于90%，阳性对照组胚胎死亡率不低于10%，板对照无鱼卵死亡。
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发光细菌所用的菌种为费氏弧菌（Vibrio fischeri），购于美国SDI公司，储藏在冰箱-22 ℃，使用前需加入复苏液。发光细菌急性毒性测试实验标准方法参考《水质 水样对弧菌类光发射抑制影响的测定（发光细菌试验）》中第三部分：使用冻干细菌法ISO 11348-3-2007[13]。取出贮存于−22℃保存的费氏弧菌冻干粉并用2 mL的Microtox稀释液（4℃保存）复苏15 min，用DeltTox毒性检测仪测定其发光度；取0.1 mL复苏菌液于比色皿中测量其初始发光度，将样品浓度分别稀释至100%、50%、25%、12.5%、6.25%，每个样品质量浓度设2个平行样，采用DeltTox毒性检测仪测定15 min发光强度。在试验中，发光细菌初始发光度≥200万光子数，在45% B-Tox中毒性模式下，当Zn2+溶液标准浓度为2.2 mg·L−1时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过±10%。试验结果由相对发光度L表示，计算公式得出：
式中，I0为对照发光强度（mV），It为样品发光强度（mV）。
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试验所用植物为黑麦草，种子纯净度98%，发芽率95%以上，购自苏农种业有限公司（江苏宿迁）。黑麦草生态指标评价试验参考《土壤质量 污染物对土壤植物群影响的测定》中第一部分：抑制根系生长的测量方法（ISO 11269-1-1993）[14]及第二部分：污染泥土对高等植物的发芽和早期生长的影响（ISO 11269-2-2012）[15]。
试验黑麦草种植容器采用表面皿，每个容器内装土样500 g，共设3个处理：对照组正常无污染土壤（B0）、场地污染土壤（B1）、微波修复后场地污染土壤（B2）；黑麦草种子经消毒后，每组播种种子20粒，土壤混匀后，初次浇水至最大持水量的80%，每天称重补水至初始状态，连续种植15 d，并测定黑麦草的发芽率、植株高度等参数，采用发芽指数、根伸长指数相关指标表征微波修复前后土中污染物的毒性效应。
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（1）斑马鱼胚胎、发光细菌毒性结果的评价采用TU值，计算如下[16]：
式中，EC50为半数效应浓度，即暴露后引起50%效应变化的稀释浓度；LC50为半数致死浓度，即暴露后引起50%死亡率的质量浓度；发光细菌15 min-EC50、斑马鱼胚胎48 h-EC50计算使用SPSS 22.0。
当受试生物暴露于100%质量浓度未经稀释的水样中，且毒性效应未达到50%，从而无法计算EC50或LC50时，TU可以通过下列公式计算得到：
式中，RE为经染毒后发光细菌的相对发光度，斑马鱼胚胎死亡率。
（2）黑麦草发芽指数、根伸长抑制指数的计算[17]：
式中，A、B分别为B1、B2的平均植株高度、发芽率；C、D分别为B0的平均植株高度、发芽率。
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图1为场地石油烃污染土壤、微波修复后土壤的斑马鱼胚胎急性毒性48 h试验结果，其中对照组未受污染的土壤未表现出毒性效应。
从图1可以看出，场地石油烃污染土壤、微波修复后土壤的质量浓度和斑马鱼胚胎毒性48 h存在浓度—效应关系，随着浸提液浓度的稀释，毒性减小。修复前后的土壤进行对比，修复前的石油烃污染土壤毒性效应明显，100%、50%质量浓度下斑马鱼胚胎死亡率达到100%，均出现凝结死亡（图2 C），25%、6.25%质量浓度下各存在1例畸形效应，主要表现为胚胎心包囊肿（图2 E），致死率分别为50%、20%，死亡胚胎存在体节未形成特征（图2 D）；修复后的石油烃污染土壤毒性较小，100%质量浓度下斑马鱼胚胎死亡率仅为30%，但存在鱼卵畸形效应（图2 F），畸形率30%，50%质量浓度下死亡率下降至30%，25%、12.5%、6.25%质量浓度下斑马鱼胚胎死亡率均有所下降，分别下降至20%、20%、10%，说明高浓度时对斑马鱼胚胎发育的影响较大，低浓度时影响较小。通过SPSS计算得出修复前48 h-EC50值为0.176 mg·L−1，修复后48 h-EC50值为5.116 mg·L−1，修复后土壤的48 h-EC50值远大于修复前，表明土壤经微波修复后，受污染土壤毒性削弱了96.6%，故修复后的土壤斑马鱼胚胎急性毒性效应明显减小。
同时，还观察了经微波修复前后土壤浸出液染毒后，斑马鱼胚胎的发育、孵化及畸形情况。主要包括24 h的20 s内主动活动、48 h的20 s内主动活动、48 h卵凝结、48 h体节未形成、48 h心包囊肿、48 h孵化率及48 h畸形率。而在这些毒性终点中比较敏感的主要是48 h心包囊肿、48 h孵化率及48 h畸形率（见图2）。
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污染土壤修复前后的发光细菌急性毒性结果见图3。发光细菌急性毒性的评价根据中国科学院南京土壤所推荐的百分数等级分数标准进行判别[18]，见表1。
结果表明，土壤的质量浓度越高，发光细菌的相对发光度越小，存在剂量效应关系。对照组未受污染的土壤相对发光度均大于90%，未呈现毒性效应；原浓度的场地石油烃污染土壤相对发光度仅为28.5%，属于高毒，经微波修复后，相对发光度为51.2%，属于中毒，毒性效应明显减弱，随着质量浓度的减小，污染土壤相对发光度不断增大，毒性逐渐减弱。通过SPSS对发光细菌毒性进行验证，计算得出修复后土壤发光细菌15 min-EC50值为1.426 mg·L−1，明显大于修复前的15 min-EC50值0.439 mg·L−1，表明经微波修复后，受污染土壤毒性削弱了69.2%，故修复后的土壤发光细菌急性毒性效应明显减弱。
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对照组正常无污染土壤（B0）、场地污染土壤（B1）、微波修复后场地污染土壤（B2），3组试验黑麦草连续种植15 d的发芽率和植株高度结果如下，图4为黑麦草生长周期现场照片，图5为黑麦草生态指标评价。
由图4和图5可见，对照组B0黑麦草生长良好，其种子出芽快且种植15 d后发芽率高达90%，微波修复前后土壤黑麦草的生长状况差异较大，修复前B1土壤黑麦草生长缓慢，发芽率低且平均植株高度仅为4.5 cm，修复后的B2土壤黑麦草生长状况良好，且种植15 d后发芽率可达65%，黑麦草平均高度可达6.8 cm，说明经过微波热修复后，土壤中的石油烃污染物大部分得到了去除，且微波修复技术未对土壤的肥力、有机质造成破坏；由土壤的发芽率、植株高度可计算B1、B2的黑麦草发芽指数、根伸长指数，得B1黑麦草发芽指数为0.15，根伸长抑制指数为0.45，B2发芽指数为0.60，根伸长抑制指数为0.17，微波修复后土壤黑麦草的发芽指数远大于修复前、根伸长抑制指数则小于修复前，表明经过微波热修复的土壤对植物毒性有明显下降，且毒性较小，毒性效应不明显。
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选用斑马鱼胚胎、发光细菌不同受试生物对修复前后的场地石油烃污染土壤进行毒性评价，但由于受试生物敏感度、差异性原因，结果无统一标准，本节采用TU毒性评价法对污染物进行毒性评价，并结合黑麦草生态指标进行土壤综合毒性风险评价，其TU值毒性分级表及结果见表2、表3。
由上述结果分析可得，场地石油烃污染土壤毒性测试均显示中毒，经过微波热修复后，土壤中的石油烃污染物基本去除，斑马鱼毒性测试结果显示无毒，但发光细菌显示微毒。研究表明，低剂量的致毒因子对生物体有促进作用，这种现象被称为毒物兴奋效应[21]。由生物毒性测试TU值可得，斑马鱼胚胎毒性当量由5.68 TU降至0.20 TU，发光细菌毒性当量由2.28 TU降至0.7 TU，急性毒性效应均明显减弱，场地污染土壤斑马鱼胚胎毒性当量为5.68 TU明显大于发光细菌毒性当量2.28 TU，这说明受试生物斑马鱼具有较高的生物敏感性，这与陈文艳等[16]的研究成果类似。
场地石油烃污染土壤重金属检测5种重金属中仅锌、铅、镍检出，含量分别为1.163、1.0246、1.8962 mg·kg−1，铜、铬均未检出，远低于《危险废物鉴别标准浸出毒性鉴别》[22]（GB5085.3-2007）中表1所规定得浸出毒性鉴别标准值（铜、锌、镍、铬、铅等5种重金属的浓度限值分别为100、100、5、15（总铬）、5 mg·L−1），因此，本次试验所用污染土壤不具有浸出重金属毒性特征。根据生物毒性测试结果，场地石油烃污染土壤经过微波热修复后毒性明显削弱，结合黑麦草生态指标，对比修复前后土壤黑麦草的生长状况，经修复后的B2组发芽指数、根伸长指数与对照组无污染土壤B0相差不大，表明在无任何化学药剂加入，全物理性修复的条件下，微波修复技术在去除污染物的同时，对土壤结构、肥力影响较小，有利于后期复耕等开发利用。
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（1）微波修复前后2种石油烃污染土壤均显示出生物毒性，经过微波热修复后，斑马鱼胚胎48 h-EC50值从0.176 mg·L−1提升至5.116 mg·L−1，修复后土壤48 h-EC50值明显大于修复前；土壤相对发光度由28.5%提升至51.2%，发光细菌15 min-EC50值从0.439 mg·L−1提升至1.426 mg·L−1，修复后土壤15 min-EC50值明显大于修复前，这表明斑马鱼胚胎、发光细菌的急性毒性效应明显减弱。
（2）石油烃污染土壤微波前B1土壤黑麦草发芽率低且平均植株高度仅为4.5 cm，修复后B2土壤黑麦草发芽率提高了40%，达65%，高度增加了2.3 cm，达6.8 cm. 修复后土壤发芽指数由0.15提升至0.60，明显大于修复前土壤，而根伸长抑制指数由0.45下降至0.17，明显小于修复前土壤。
（3）TU毒性评价表明，石油烃污染土壤修复后斑马鱼胚胎毒性当量由5.68 TU降至0.20 TU，发光细菌毒性当量由2.28 TU降至0.7 TU，急性毒性效应均明显减弱，由中毒转化为无毒；场地污染土壤斑马鱼胚胎毒性当量为5.68 TU明显大于发光细菌毒性当量2.28 TU，说明受试生物斑马鱼具有较高的生物敏感性。由于是物理性修复，对于土壤结构、肥力影响较小，有利于后期复耕等开发利用。
石油烃污染场地的微波修复土壤急性毒性及生态风险评价
Assessment of acute soil toxicity and ecological risk in microwave remediation of petroleum hydrocarbon contaminated sites
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摘要: 为了准确评估微波修复后的场地石油烃污染土壤急性毒性和生态风险，采用斑马鱼胚胎急性毒性试验、发光细菌急性毒性试验和黑麦草生态指标试验进行测试，结合理化指标参数，通过毒性当量（TU）法对对照无污染土壤（B0）以及修复前、后土壤（B1、B2）的生物毒性进行综合评价。结果表明，微波修复前土壤显示出生物毒性，修复后土壤与修复前相比仍显示出生物毒性，但其毒性明显减弱；修复后土壤黑麦草生长状况良好，与修复前相比，黑麦草发芽率提高了40%，达65%，高度增加了2.3 cm，达6.8 cm，修复后土壤发芽指数由0.15提升至0.60，明显大于修复前土壤，而根伸长指数由0.45下降至0.17，明显小于修复前土壤；斑马鱼胚胎毒性当量由5.68 TU降至0.20 TU，发光细菌毒性当量由2.28 TU降至0.7 TU，急性毒性效应均明显减弱。本研究可为石油烃污染土壤修复工程毒性综合评价和人体健康风险评估工程设计和工程竣工验收提供参考。Abstract: To accurately assess the acute toxicity and ecological risk of oil hydrocarbon contaminated soil in the site after microwave repair, the acute toxicity test of zebrafish embryos, the acute toxicity test of luminescent bacteria, and the ecological index test of ryegrass were used for testing, and the biotoxicity of controlled non-polluting soil (B0) and pre-and post-repair soil (B1, B2) was evaluated by toxicity equivalent (TU) method. The results showed that the soil showed biotoxicity before microwave remediation, and the soil still showed biotoxicity after remediation, but the toxicity was significantly reduced compared with that before remediation. After the restoration, the soil ryegrass grew well. Compared with the pre-repair period, the germination rate of ryegrass increased by 40%, up to 65%, and the height increased by 2.3 cm, up to 6.8 cm. The germination index of soil after restoration increased from 0.15 to 0.60, which was significantly higher than that of soil before restoration, while the root elongation index decreased from 0.45 to 0.17, which was significantly lower than that of soil before restoration.The zebrafish embryonic toxicity equivalent was reduced from 5.68 TU to 0.20 TU, and the luminescent bacterial toxicity equivalent was decreased from 2.28 TU to 0.7 TU, and the acute toxicity effect was significantly reduced. This study can provide a reference for the comprehensive evaluation of the toxicity of petroleum hydrocarbon contaminated soil restoration project and the design and completion acceptance of human health risk assessment.
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图 1 微波修复前后场地石油烃污染土壤对斑马鱼胚胎的急性毒性
Figure 1. Acute toxicity of petroleum hydrocarbon contaminated soil on zebrafish embryos before and after microwave remediation
图 2 微波修复前后场地石油烃污染土壤对斑马鱼胚胎生长发育的影响
Figure 2. Effects of petroleum hydrocarbon contaminated soil on the growth and development of zebrafish embryos before and after microwave remediation
图 3 微波修复前后场地石油烃污染土壤对发光细菌的急性毒性
Figure 3. Acute toxicity of petroleum hydrocarbon contaminated soil to Photobacteria before and after microwave remediation
图 4 微波修复前后场地石油烃污染土壤对黑麦草生长周期的影响
Figure 4. Effects of petroleum hydrocarbon contaminated soil on ryegrass growth cycle before and after microwave remediation
图 5 微波修复前后场地石油烃污染土壤黑麦草生态指标评价（15 d）
Figure 5. Evaluation of ryegrass ecological index before and after microwave remediation (15 d)
毒性级别Toxicity level 相对发光率L/% Relative luminous rate 毒性结果Toxicity results 0 L>90 无毒 Ⅰ 70<L≤90 低毒 Ⅱ 50<L≤70 中毒 Ⅲ 30<L≤50 重毒 Ⅳ 0<L≤30 高毒 Ⅴ L=0 剧毒 
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TU 毒性级别Toxicity level 毒性结果Toxicity results <0.4 Ⅰ 无毒 0.4<TU<1 Ⅱ 微毒 1<TU<10 Ⅲ 中毒 10<TU<100 Ⅳ 高毒 TU>100 Ⅴ 剧毒
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表 3 石油烃污染场地土壤毒性评价结果
Table 3. Toxicity evaluation results of polluted soil
土壤种类Soil species 斑马鱼胚胎Zebrafish embryos 发光细菌Glowing bacteria TU 毒性等级Toxicity level TU 毒性等级Toxicity level 对照组 0.10 无毒 0.05 无毒 微波修复前 5.68 中毒 2.28 中毒 微波修复后 0.20 无毒 0.70 微毒
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